Acta Herediana vol. 64, N° 1, enero 2021 - junio 2021
1 PhD. en bioquímica. Laboratorio de Genómica
Funcional, Departamento de Ciencias Biológicas
y Fisiológicas, Facultad de Ciencias y Filosofía,
Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima,
Perú.
Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna.
Fuente: https://www.quo.es/ciencia/
Las Tijeras GenéTicas:
Premio nobeL de Química
deL 2020
Genetic Scissors: 2020 Nobel Prize in Chemistry
Luis de sTefano-beLTrán
1
resumen
El autor nos presenta a Emmanuelle Charpentier y Jennifer
Doudna ganadoras del Premio Nobel de Química 2020 por haber
desarrollado una de las técnicas más precisas de edición genética
conocida como CRISPR/Cas9 o tijeras genéticas.
Palabras claves: Premio Nobel, química, genética, genoma.
absTracT
The author introduces us to Emmanuelle Charpentier and Jennifer
Doudna who won the 2020 Nobel Prize in Chemistry for having
developed one of the most accurate genetic editing techniques
known as CRISPR/Cas9 or genetic scissors.
Keywords: Nobel Prize, chemistry, genetics, genome.
E
l pasado 22 de febrero del presente año
los cables anunciaron un desarrollo
tecnológico que hasta hace solo unos
años habría parecido como sacado de una
revista popular de ciencia cción. Cientícos
del Cold Spring Harbor Laboratory, uno de
los centros de investigación más prestigiosos
en el mundo, anunciaron en Nature Plants que
habían logrado editar el genoma del maíz con el
objetivo de aumentar el número de granos por
choclo así como el tamaños de los mismos con
la promesa de, en muy corto tiempo, obtener
variedades con 50% más de rendimiento que
las actuales.
1
Hace solo una semana un grupo del Innovation
Academy for Seed Design en la Chinese
Academy of Sciences reportó en la revista Cell
la domesticación de novo de un arroz silvestre
abriendo con ello la posibilidad de domesticar
nuevos cultivos en una fracción del tiempo de
lo que normalmente tomó para los actuales
cultivos.
2
Estos dos avances tecnológicos
relacionados a la agricultura y otros igual de
revolucionarios en biomedicina no hubiesen
sido posibles hace solo ocho años. En las
siguientes líneas trataré de introducirlos a la
tecnología de edición de genomas y para ello
comenzaré con su momento culminante, el
anuncio de los ganadores del Premio Nóbel de
Química del 2020.
El pasado 7 de octubre Göran K. Hansson,
Secretario General de la Real Academia de
las Ciencias de Suecia, inició el anuncio de las
ganadoras del Premio Nóbel de Química del
2020 con estas palabras: “…El premio de este
año consiste en reescribir el código de la vida…”.
Era el reconocimiento de que por primera vez
la especie humana era capaz de modicar
su propio código y el de otras especies, un
verdadero parteaguas en la corta historia
evolutiva del Homo sapiens sobre la tierra.
El Dr. Hansson continuó con el anuncio de
los nombres de las ganadoras: la francesa
Emmanuelle Charpentier y la estadounidense
Jennifer Doudna por el desarrollo de un método
para la edición genómica. El desarrollo de
este revolucionario método representa,
sin embargo, el trabajo de una docena de
cientícos alrededor del mundo quienes
ayudaron con la dilucidación, primero, del
sistema inmunológico adaptativo bacteriano
CRISPR-Cas para dar luego al método mismo.
La historia de este método comienza hace unos
30 años en el pequeño puerto de Santa Pola
ubicada en la región de Costa Blanca, España,
a pocos kilómetros de Alicante y conocida por
sus marismas y salinas. Un joven Francisco
Mojica iniciaba su doctorado en la Universidad
de Alicante en 1989 después de obtener su B.S.
en biología de la Universidad de Valencia. Su
tutor, Francisco Rodríguez-Valera, trabajaba
con una arquea, la Haloferax mediterranei, aislada
precisamente de las salinas de Santa Paola, y
responsable del color rosáceo que adquieren
las salinas cuando aumenta la concentración
de la sal. El joven estudiante recibió el encargo
de elucidar porqué la concentración de sal en
el medio de cultivo parecía afectar la manera
en que las enzimas de restricción cortaban
el DNA de esta halobacteria. Fue así que
Francisco Mojica comenzó a caracterizar los
fragmentos alterados del genoma mediante el
secuenciamiento de DNA.
Cuenta Mojica que en el verano de 1992 un
joven becario le recitaba la secuencia de bases
reveladas en la película de rayos X mientras
él apuntaba la secuencia letra a letra en su
cuaderno de laboratorio hasta que lo paró en
seco para reclamarle que se había equivocado
pues le acababa de repetir una secuencia que
ya le había dictado. Comenzaron de nuevo y
una y otra vez encontraron la misma secuencia
reiterada muchas veces. Era una secuencia de
30 bases, un palíndromo casi perfecto, separado
por secuencias espaciadoras de 36 bases sin
homología a nada conocido hasta ese momento
en bacterias.
3
Muy pronto su curiosidad lo llevó
a estudiar otras arqueas, una dentro del mismo
género, Haloferax volcanii y otras arqueas
halofílicas mucho más distantes –Haloarcula
spp,- y en todas ellas encontró secuencias
repetidas similares. Cuando revisó la literatura
encontró que Yoshizumi Ishino en 1987 y Peter
Hermans en 1991 habían reportado secuencias
repetidas similares en Escherichia coli, una
bacteria gramnegativa, y en Mycobacterium
tuberculosis, una grampositiva, aunque con
diferente secuencia. Mojica concluyó que
estaba ante una función fundamental para
todos los procariotas.
4
Durante los próximos diez años el único
interesado en estas secuencias en el mundo
fue Mojica quien después de unas cortas
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estadías postdoctorales en la Universidad de
Utah (Prof. John S. Parkinson) y Universidad
de Oxford (Prof. Christopher F. Higgins)
había regresado a la Universidad de Alicante
como miembro junior de la División de
Microbiología del Departamento de Fisiología,
Genética y Microbiología. Mojica bautizó a
estas secuencias repetidas con el acrónimo
SRSRs (Short Regularly Spaced Repeats).
Posteriormente, en un intercambio epistolar
con el microbiólogo Ruud Jansen, sugirió
cambiarlo a Clustered Regularly Interspaced
Palindromic Repeats (CRISPR). Mojica
recuerda que Ruud le dijo: “Qué buen acrónimo
es CRISPR …Tiene gancho”.
5
Ruud Jansen de
hecho usó el acrónimo por primera vez en la
literatura cuando anunció la caracterización de
los genes Cas (CRISPR-associated).
6
No fue sino hasta agosto del 2003 cuando
Mojica en un momento eureka logro descifrar
el enigma de las secuencias espaciadoras:
éstas correspondían a secuencias cortas de
virus de bacterias, los llamados bacteriófagos,
insertadas en el genoma de las bacterias como
memorabilia de contactos previos con patógenos
virales. En todos los casos, las bacterias eran
resistentes a los virus cuyas secuencias se
encontraban presentes como secuencias
espaciadoras en sus genomas. Se trataba de un
sistema inmune adaptativo bacteriano nunca
antes descrito. Semejante descubrimiento debía
ser reportado de inmediato. Cuenta Mojica
que su artículo anunciando este sosticado
sistema de defensa bacteriano fue rechazado
por cuatro revistas a lo largo de seis meses:
Nature, Proceedings of the National Academy of
Sciences, Molecular Microbiology y Nucleic Acid
Research antes que fuera aceptado nalmente
por el Journal of Molecular Evolution donde fue
publicado, después de un año de revisiones,
el 1 de febrero de 2005.
7
Curiosamente, otros
dos grupos franceses encabezados por Gilles
Vergnaud y Alexander Bolotin reportaron
resultados muy similares a los de Mojica en
Yersinia pestis y Streptococcus thermophilus,
respectivamente, en marzo y septiembre del
mismo año.
8,9
Durante los próximos años varios grupos
alrededor del mundo fueron añadiendo las
piezas faltantes al rompecabezas de este sistema
de defensa propuesto por Mojica. Finalmente
fue emergiendo una gran diversidad de
sistemas CRISPR organizados actualmente en
dos clases generales y subdivididas en cinco
tipos cuya descripción en detalle escapa al
propósito del presente artículo.
En la Figura 1 se presenta uno de los sistemas
CRISPR más simples perteneciente a la
Clase 2, Tipo II de Streptococcus thermophilus
y S. pyogenes. Este locus CRISPR contiene
un arreglo de secuencias CRISPR (CRISPR
array) con regiones repetidas (diamantes
negros) separadas por regiones espaciadoras
(rectángulos de colores) derivadas de
diferentes virus invasores así como cuatro
genes codicadores de proteínas (cas9, cas1,
cas2, y csn2). El gen cas9 codica una nucleasa,
Cas9, que conere inmunidad al cortar el
DNA invasor con una perfecta homología
a las regiones espaciadoras. Los otros tres
genes cas1, cas2 y csn2, codican proteínas
involucradas en la adquisición de nuevas
secuencias espaciadoras a partir del DNA de
virus invasores. El tercer elemento del locus
CRISPR es la secuencia tracrRNA (trans-
activating CRISPR RNA) cuyo transcrito
representa, sorprendentemente, el tercer RNA
más abundante después de rRNA y tRNA.
El transcrito tracrRNA es un pequeño RNA
no codicante que posee una secuencia de 24
nucleótidos de casi perfecta complementaridad
con las secuencias repetidas del arreglo
CRISPR que también son transcritas como un
precusor largo pre-crRNA (CRISPR RNA).
Estos dos RNAs se hibridizan a través de la
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secuencia complementaria y son procesadas a
formas más cortas por la RNAsa III y la Cas9. El
complejo terciario Cas9 + tracRNA + crRNA se
embarca a la búsqueda de secuencias de DNA
que coincidan con la secuencia espaciadora
(en rojo). La unión de la Cas9 requiere la
presencia de una secuencia motif adyacente al
protoespaciador (PAM, Protospacer Adjacent
Motif) en la secuencia blanco que funciona
como una suerte de asa molecular a la que
se sujeta la nucleasa. Una vez que la Cas9 se
une al sitio blanco con una coincidencia en
secuencia entre el crRNA y el DNA blanco,
corta el DNA tres bases 5´o corriente arriba
(upstream) del sitio PAM. La nucleasa Cas9
posee dos dominios de endonucleasa, el HNH
y el RuvC, los que cortan, respectivamente, la
cadena complementaria y no complementaria
del DNA blanco creando extremos romos a
través de una rotura de doble cadena (double
strand break).
Emmanuelle Marie Charpentier nació el 11
de diciembre de 1968 en Juvisy-sur-Orge, a
25 km de París, en Francia. En 1992 se graduó
con un título en bioquímica de la Universidad
Pierre y Marie Curie (la UPMC forma parte
de la Universidad de Sorbona desde el
2018). Obtuvo su PhD. en Microbiología en
el Instituto de Pasteur bajo la dirección de
Patrice Courvalin en 1995. Sorprendemente,
en sus dos primeros artículos en los que
publica resultados de su tesis de doctorado,
la joven estudiante de doctorado es la autora
de correspondencia.
10,11
Después de una corta
estancia postdoctoral en el mismo Instituto,
Figura 1. Sistema CRISPR-Cas9 Clase 2, Tipo II de Streptococcus thermophilus.
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Charpentier viajó a los Estados Unidos donde
completó varias estancias postdoctorales en
la Universidad Rockefeller, el Centro Médico
Langone de la Universidad de Nueva York, el
Instituto Skirball de Medicina Biomolecular,
en Nueva York, y el Hospital de Investigación
Infantil St. Jude, en Memphis. En 2002 regresó
a Europa a la Universidad de Viena en
Austria y en 2009 se incorporó al Centro de
Investigación Microbiana de la Universidad
de Umeå, Suecia.
Después de descubrir el tracRNA y elucidar
su rol en la maduración de los crRNAs en
colaboración con Jörg Vogel del Grupo de
Biología del RNA en el Instituto de Biología
Molecular de la Infección en la Universidad
de Würzburg, en Würzburg, Alemania,
Emmanuelle Charpentier y su equipo
pusieron a prueba todos sus conocimientos
en bioquímica para embarcarse en la
caracterización bioquímica del sistema CRISPR
in vitro.
12
Pronto iban a conocer a una aliada y
colaboradora crucial.
La historia se puso más interesante cuando,
en marzo de 2011, Charpentier fue invitada a
dar una conferencia plenaria en una reunión
cientíca, “Regulando Bacteria con RNA”
organizada por la Sociedad Americana
de Microbiología en Puerto Rico donde
conoció a Jennifer Doudna, una bióloga
estructural estadounidense y experta en RNA
mundialmente conocida.
Jennifer Doudna nació el 19 de febrero de 1964
en Washington, DC, EE.UU., en una familia
académica. Cuando cumplió siete años de
edad la familia se mudó a Hawaii. Su padre
fue Profesor de literatura estadounidense en la
Universidad de Hawaii, en Hilo, y su madre
enseñó historia en un community college. En
1985 obtuvo su B.Sc. en Química en Pomona
College y su PhD. de la Universidad de
Harvard bajo la dirección de Jack W. Szostak,
en 1989. Su interés en el RNA se inició con
su trabajo de tesis para su doctorado. Logró
rediseñar un intrón capaz de autoempalmarse
en una ribozima con habilidad de copiar un
molde de RNA. Este interés inicial se amplió
a la biología estructural en el laboratorio de
Thomas R. Cech en la Universidad de Colorado
y Premio Nóbel de Química en 1989, donde fue
capaz de resolver varias estructuras cristalinas
de ribozimas.
Las dos cientícas decidieron unir esfuerzos
para caracterizar el sistema CRISPR en
Streptococcus pyogenes. Para ello usaron Cas9
recombinante de S. pyogenes expresada en E.
coli así como tracRNA y crRNA transcritos in
vitro. Con esos ingredientes moleculares fueron
capaces no solo de demostrar que Cas9 cortaba
DNA in vitro sino que su especicidad contra
DNA podía ser reprogramada con crRNAs
hechos a la medida. También fueron las
primeras en crear un RNA quimera fusionando
en una sola molécula al tracRNA y crRNA para
dar lugar al RNA guía (single-guide RNA o
sgRNA) y demostraron que era tan funcional
in vitro como sus componentes separados (ver
Figura 2). Charpentier y Doudna enviaron sus
resultados a la revista Science el 8 de junio del
2012 y el artículo fue publicado en línea en
tiempo récord solo veinte días después, el 28 de
junio.
13
Sin embargo, el grupo encabezado por
Virginijus Siksnys había enviado un artículo con
resultados muy similares (excepto el sgRNA) a
la revista Cell el 6 de abril de ese mismo año.
Desafortunadamente, el artículo fue rechazado
y devuelto a sus autores sin revisión por
pares solo seis días después. Siksnys decidió
entonces trabajar en una versión mucho más
corta de su artículo y lo envió a PNAS el 21 de
mayo pero no fue publicado en línea sino hasta
el 4 de septiembre, un poco más de dos meses
después del de Charpentier y Doudna.
14
De
haber sido aceptado el artículo de Siksnys por
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la revista Cell quizás otro habría sido el destino
del premio Nóbel de Química del 2020.
La primera aplicación del método de
Charpentier y Doudna para reprogramar el
sitio blanco de la Cas9 fue realizada por Feng
Zhang y su equipo en el Department of Brain
and Cognitive Sciences del Massachusets
Institute of Technology. Zhang fue capaz
de demostrar edición del genoma en varios
loci de células humanas y de ratón mediante
la modicación del RNA guía así como
la modicación simultánea de varios loci
usando diferentes secuencias guías en un solo
crRNA.15 Su artículo fue enviado a Science el
12 de octubre del 2012 y apareció en línea el
3 de enero del 2013. Se convirtió en el artículo
más citado en el campo de edición genómica
mediante CRISPR.
referencias bibLioGráficas
1. Liu L, Gallagher J, Arevalo ED, Chen R, Skopelitis
T, Wu Q, Bartlett M, Jackson D. Enhancing grain-
yield-related traits by CRISPR– Cas9 promoter
editing of maize CLE genes. Nature Plants. 2021; 7,
287-294.
2. Yu H, Lin T, Meng X, Du H, Zhang J, Liu G, et al. A
route to de novo domestication of wild
allotetraploid rice. Cell. 2021; 184, 1156-1170.
3. Mojica FJ, Juez G, Rodríguez-Valera F.
Transcription at dierent salinities of Haloferax
mediterranei sequences adjacent to partially
modied PstI sites. Mol Microbiol. 1993;9, 613-621.
4. Mojica FJ, Ferrer C, Juez G, Rodríguez-Valera F.
Long stretches of short tandem repeats are present
in the largest replicons of the Archaea Haloferax
mediterranei and Haloferax volcanii and could be
involved in replicon partitioning. Mol Microbiol.
1995;17, 85-93.
5. Mojica FJ. Prólogo. Editando genes: recorta, pega
y colorea: Las maravillosas herramientas CRISPR
de Lluís Montoliu. Next Door Publishers. 2018
6. Jansen R, Embden JDAV, Gaastra W, and Schouls
LM. Identication of genes that are associated
with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol.
2002; 43, 1565-1575.
7. Mojica FJM, Díez-Villaseñor C, García-Martínez
J. and Soria E. Intervening sequences of regularly
spaced prokaryotic repeats derive from foreign
genetic elements. J Mol Evol. 2005; 60, 174-182.
8. Pourcel C, Salvignol G, and Vergnaud G. CRISPR
elements in Yersinia pestis acquire new repeats
by preferential uptake of bacteriophage DNA, and
provide additional tools for evolutionary studies.
Microbiology. 2005; 151, 653-663.
9. Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, and Ehrlich SD.
Clustered regularly interspaced short palindrome
repeats (CRISPRs) have spacers of
extrachromosomal origin. Microbiology. 2005; 151,
2551-2561.
10. Charpentier E, Gerbaud G, Courvalin P.
Characterization of a new class of tetracycline-
resistance gene let(S) in Listeria monocytogenes
BM4210. Gene. 1993; 131, 27-34.
11. Charpentier E, Gerbaud G, Courvalin, P. Presence
of the Listeria Tetracycline Resistance Gene tet(S)
in Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy. 1994; 38, 2330-2335.
12. Deltcheva, E., Chylinski, K., Sharma, C. et al.
CRISPR RNAmaturation by trans-encoded small
RNA and host factor RNase III. Nature. 2011; 471,
602-607.
13. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna
JA, and Charpentier E. (2012). A programmable
dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive
bacterial immunity. Science. 2012; 337, 816–821.
Figura 2. RNA guía (sgRNA) desarrollado por Charpentier y
Doudna (2012).
Acta Herediana vol. 64, N° 1, enero 2021 - junio 2021
100
14. Gasiunas G, Barrangou R, Horvath P, and Siksnys
V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex
mediates specic DNA cleavage for adaptive
immunity in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2012;109, E2579-E2586.
15. Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib, et
al. Multiplex genome engineering using CRISPR/
Cas systems. Science. 2013;339, 819-823.
Fecha de recepción: 17-03-2021.
Fecha de aceptación: 22-03-2021.
Conicto de interés: ninguno, según el autor.
Financiamiento: por el autor.
